Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Раствор С - два ряда разведений воды для ИБЭ, содержащей стандарт эндотоксина в концентрациях 2Л, 1Л, 0,5Л, 0,25Л,
Раствор D - вода для ИБЭ (отрицательный контроль).
(ii) Вычисления и интерпретация
Результаты испытания считают достоверными при выполнении следующих трех условий:
(а) раствор D (отрицательный контроль) в обеих повторностях дает отрицательный результат,
(б) раствор В (положительный контроль с препаратом) в обеих повторностях дает положительный результат,
(с) среднее геометрическое концентраций в конечных точках для раствора С находится в пределах от 0,5Л до 2Л.
Для определения концентрации эндотоксинов в растворе А вычисляют концентрации в конечных точках для каждого ряда разбавлений в каждой из повторностей путем умножения фактора разбавления в конечной точке на Л.
За концентрацию эндотоксина в испытуемом растворе принимают среднее геометрическое концентраций в конечных точках в повторных экспериментах (см. формулу в подразделе «1. Предварительные испытания. (i) Подтверждение чувствительности лизата, указанной на этикетке»). Если испытание проводят с разбавленным испытуемым раствором, концентрацию эндотоксина в исходном растворе получают путем умножения на фактор разбавления.
Если ни одно из разведений испытуемого раствора в ходе испытания с подтвержденной достоверностью не дает положительного результата, концентрацию эндотоксинов регистрируют как «менее Л» (или, в случае использования разбавленного образца, как «менее (Л х наименьший фактор разведения образца)»). Если для всех разведений получен положительный результат, то концентрация эндотоксинов регистрируется как «равная или превышающая максимальный фактор разведения, умноженный на Л» (например, в Таблице 2.6.14.-3, это значение равно исходному фактору разведения х 8 х Л).
Препарат соответствует требованиям испытания, если концентрация эндотоксина менее указанной в частной статье.
ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (МЕТОДЫ С, D, E и F)
1. ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ ПРИНЦИП (МЕТОДЫ С и F)
Данный принцип представляет собой фотометрическое испытание, основанное на измерении увеличения степени мутности. В зависимости от используемого подхода, с использованием данного метода могут быть проведены турбидиметрическое
испытание методом конечной точки и кинетическое турбидиметрическое испытание.
Турбидиметрический метод конечной точки (метод F) основан на количественном соотношении между концентрацией эндотоксина и степенью мутности (выражающейся в пропускании или поглощении света) реакционной смеси в конце инкубационного периода.
Кинетическое турбидиметрическое испытание (метод С) заключается либо в измерении времени, требующегося для достижения заданного значения поглощения в реакционной смеси, либо в определении скорости увеличения степени мутности.
Испытание проводят при температуре инкубации, рекомендованной производителем лизата (обычно 37±10).
2. ХРОМОГЕННЫЙ ПРИНЦИП (МЕТОДЫ D и E)
Данный принцип основан на измерении количества хромофора, высвобождаемого из соответствующего хромогенного пептида в результате реакции эндотоксинов с лизатом. В зависимости от используемого подхода, с использованием данного метода могут быть проведены хромогенное испытание методом конечной точки и кинетическое хромогенное испытание.
Хромогенный метод конечной точки (метод Е) основан на количественном соотношении между концентрацией эндотоксина и количеством хромофора, высвобождаемого к концу инкубационного периода.
Кинетическое хромогенное испытание (метод D) заключается либо в измерении времени, требующегося для достижения заданного значения поглощения в реакционной смеси, либо в определении скорости появления окраски.
Испытание проводят при температуре инкубации, рекомендованной производителем лизата (обычно 37±10).
3. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ
Предварительные испытания проводят для обеспечения точности и достоверности результатов турбидиметрических и хромогенных испытаний. В ходе предварительных испытаний подтверждают выполнение критериев стандартной кривой и отсутствие мешающего влияния испытуемого раствора на результаты испытания.
При внесении любых изменений в экспериментальные условия, которые могут повлиять на результаты, требуется подтверждение пригодности метода испытания.
(i) Подтверждение выполнения критериев стандартной кривой
Для получения стандартной кривой готовят не менее трех концентраций эндотоксина с использованием стандартного раствора эндотоксина. Проводят испытание с каждым стандартным раствором эндотоксина не менее трех раз в соответствии с рекомендациями производителя лизата (объемные отношения, время инкубации, температура, рН и т.д.).
Если при использовании кинетических методов желаемый интервал в логарифмической шкале превышает 2, в испытание должны быть включены дополни-
тельные стандарты для включения каждого увеличенного логарифмического значения в диапазон стандартной кривой.
